检测原理

      试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。往预先包被穿孔素(PF)抗体的包被微孔中,依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体,经过温育并 洗涤。用底物TMB显色,TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的穿孔素(PF)呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度(OD 值),计算样品浓度。
  样品收集、处理及保存方法
  1. 血清:使用不含热原和内毒素的试管,操作过程中避免任何细胞刺激,收集血液后,3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
  2. 血浆:EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。
  3. 细胞上清液:3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。
  4. 组织匀浆:将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。
  5. 保存:如果样本收集后不及时检测,请按一次用量分装,冻存于-20℃,避免反复冻融,在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻

       自备物品
      1.酶标仪(450nm)
      2.高精度加样器及枪头:0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
      3.37℃恒温箱。
  操作注意事项
  1. 试剂盒保存在2-8℃,使用前室温平衡20分钟。从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶,这属于正常现象,水浴加热使结晶完全溶解后再使用。
  2. 实验中不用的板条应立即放回自封袋中,密封(低温干燥)保存。
  3. 浓度为0的S0号标准品即可视为阴性对照或者空白;按照说明书操作时样本已经稀释5倍,最终结果乘以5才是样本实际浓度。
  4. 严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。
  5. 所有液体组分使用前充分摇匀。
  试剂的准备
  20×洗涤缓冲液的稀释:蒸馏水按1:20稀释,即1份的20×洗涤缓冲液加19份的蒸馏水。
  洗板方法
  1. 手工洗板:甩尽孔内液体,每孔加满洗涤液,静置1min后甩尽孔内液体,在吸水纸上拍干,如此洗板5次。
  2. 自动洗板机:每孔注入洗液350μL,浸泡1min,洗板5次。
  操作步骤
  1. 从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条,剩余板条用自封袋密封放回4℃。
  2. 设置标准品孔和样本孔,标准品孔各加不同浓度的标准品50μL;
  3. 样本孔先加待测样本10μL,再加样本稀释液40μL;空白孔不加。
  4. 除空白孔外,标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测100μL,用封板膜封住反应孔,37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
  5. 弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液,静置1min,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板)。
  6. 每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。
  7. 每孔加入终止液50μL,15min内,在450nm波长处测定各孔的OD值。
  试剂盒性能
      1. 准确性:标准品线性回归与预期浓度相关系数R值,大于等于0.9900。
      2.灵敏度:最di检测浓度小于0.1 U/mL,
      3. 特异性:不与其它可溶性结构类似物交叉反应。
      4. 重复性:板内、板间变异系数均小于15%。
      5. 贮藏:2-8℃,避光防潮保存。
      6.有效期:6个月
      免责声明
      1.试剂盒仅供研究使用,不得用于临床实验或人体实验,否则所产生的一切后果,由实验者承担,本公司概不负责。

      2.严格按照说明书操作,实验者违反说明书操作,后果由实验者承担。

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